Interacción entre la oncoproteína E5 de HPV16 y Ras en el proceso de transformación celular.

Abstract

RESUMEN Objetivo Determinar si E5 de HPV16 modifica la señalización mitogénica de RasG12V en el proceso de transformación celular. Material y métodos A partir de embriones de ratón de la cepa FvB/Ntac con 13 días de gestación, se generó una línea celular de fibroblastos, los cuales fueron obtenidos a partir de la disgregación de los embriones y tratamiento con tripsina de acuerdo a lo reportado por Heidcamp (2009). Después de 3 meses de pasajes continuos los fibroblastos presentaron un período de crisis, después de lo cual sólo aquellas células que se inmortalizaron pudieron sobrevivieron y continuaron creciendo, a esta línea celular se le denominó MEFFvB. Posteriormente, esta línea celular inmortalizada fue transfectada con plásmidos que contienen los diferentes oncogenes de interés: E5 y E7 de HPV16 en el plásmido pcDNA3 y el oncogene rasG12V así como ras116Y (dominante negativo) en el plásmido pBabe, ya sea de manera individual o combinados. El oncogen rasG12V presenta una mutación que sustituye glicina por valina en la posición 12, lo cual provoca que la proteína Ras expresada por este gen se encuentre siempre unida a GTP, y por tanto esta proteína se encuentra activa de manera constitutiva. Por su parte, el oncogén ras116Y es un mutante que tiene tirosina en lugar de asparagina en la posición 116, lo que impide que la proteína Ras expresada se una a GTP, por lo que la señalización transducida por ésta se ve afectada negativamente (Ogiso et al., 1990) Resultados Los cultivos primarios embrionarios de la cepa de ratón FvB que se generaron fueron obtenidos a partir de 8 embriones, los cuales fueron disgregados por tratamiento enzimático como se describió en la metodología. A partir de estos, se logró obtener el cultivo de los fibroblastos de uno sólo de los embriones, al que se denominó ratón “A”. Estas células se mantuvieron en cultivo continuo haciendo pases de las células al llegar a confluencia (una vez por semana). Las células se expandieron y fueron congeladas en el pase 9, considerándose hasta este momento como cultivos primarios. Los cultivos se mantuvieron en cultivo continuo con pases cada semana y aproximadamente después del pase 20 las células sufrieron un lapso de crisis en donde dejaron de incrementarse por varios días, para después proliferar hasta volverse una línea inmortalizada a la cual se le denominó MEF-FvB. En este punto se consideró que las células estaban aptas para poder realizar la transfección con los diferentes oncogenes (E5 y E7 de HPV16, rasG12V y ras116Y). Conclusiones 1. E5 de HPV16 regula de manera negativa la capacidad transformante de RasG12V al ser expresadas simultáneamente en una misma célula. 2. E5 de HPV16 y RasG12V se encuentran en el mismo camino de señalización asociado a EGF y es posible que compitan por una proteína blanco, lo que provoca una disminución en la transformación celular. 3. Alteraciones en el fondo genético de la línea parental FvB (ausencia de p21Waf1) facilitó la obtención de las líneas celulares transformadas con los oncogenes E5 de HPV16 y rasG12V, pero hizo compleja la interpretación de los resultados. 4. Los complejos de cycD/Cdk4/6 son capaces de secuestrar a p21Waf1 y p27Kip1, lo cual puede explicar los altos niveles de ciclina D1 y niveles fluctuantes de p21Waf1 y p27Kip1 en la mayoría de las líneas celulares. 5. Debido al fondo genético de la línea parental, es probable que la mayor expresión de p27Kip1 esté tratando de compensar la ausencia de p21Waf1. 6. Es claro que E5 de HPV16 puede contrarrestar la transformación celular inducida por el oncogén rasG12V cuando se expresan al mismo tiempo, lo cual puede indicarnos que el papel de E5 durante la infección por HPV tal vez no sea desacoplar el ciclo celular (como lo hacen E6 y E7); sino precisamente evitar que la célula experimente una replicación descontrolada e inestabilidad genómica ya que estos eventos evitan que el propio virus concluya su ciclo vital. 7. Nuestra teoría es que E5 se expresa justamente en los estadios tempranos de la infección por HPV aumentando los estímulos mitogénicos para asegurar que la célula hospedera se replique lo suficiente para mantener el genoma viral pero evitando que E6 y E7 dañen en demasía a la célula hospedera. Sin embargo, cuando el genoma del virus se inserta en el genoma del hospedero, el marco de lectura de E5 se pierde, por lo que la expresión de esta proteína desaparece, de manera que la expresión descontrolada de E6 y E7 causa alteraciones tanto en el ciclo de replicación como en otros eventos celulares, por lo que la célula termina transformándose. Es decir, es probable que E5 de HPV, más que un oncogén, es necesario para asegurar la correcta culminación del ciclo de vida del virus del papiloma humano.